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北大开发新型光敏，实现Cas9高时空分辨率调控

生物世界
2020-09-12 11:13·优质科技领域创作者

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撰文：nagashi

CRISPR-Cas系统是一种十分强大的基因编辑工具。近年来，CRISPR技术通过Cas蛋白靶向基因并对其进行定点操作，从而突变或修正靶基因。与此同时，CRISPR技术还在基因治疗、核酸定位以及核酸检测等领域展现出良好的应用前景。

由此看来，作为一种目前广泛使用的基因编辑工具，对具有高时空分辨率的CRISPR/Cas9系统进行精确控制是研究基因调控和编辑的必要条件。

近日，北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室汤新景团队在 Angewandte Chemie 杂志上发表了题为：Optical Control of a CRISPR/Cas9 System for Gene Editing by Using Photolabile crRNA 的研究论文【1】。

这项研究开发了一种新型的光控crRNA（向导RNA）——通过维生素E和5'末端的光敏基团来灭活CRISPR/Cas9系统。维生素E修饰不影响Cas9/crRNA/tracrRNA核糖核蛋白复合物（RNP）的形成，但会抑制RNP与靶DNA的相互作用。

通过这一特殊的光控CRISPR/Cas9系统成功实现了光诱导的人类血管内皮细胞生长因子A （VEGFA）基因组编辑，并降低了EGFP稳定表达细胞系中的EGFP表达。这种crRNA-caged策略为CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑的时空光调控提供了新的方法。

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究其根源，CRISPR-Cas系统是一种广泛存在于原核及古核生物的免疫系统，Cas蛋白具有许多种亚型，其中Cas9蛋白是目前最常用的基因编辑系统。CRISPR-Cas系统可以摄取外源DNA片段，并将其插入到自身的间隔序列中，新的间隔序列转录的crRNA引导Cas蛋白特异性切割与之互补的DNA序列。

但值得注意的是，在传统的CRISPR-Cas9基因编辑过程中，crRNA引导Cas蛋白在正确的位置与DNA结合并不是立即发生的，有时需要几个小时。这意味着CRISPR-Cas9基因编辑具有延时性。

因此，CRISPR-Cas9基因编辑过程经常观察到不必要的脱靶效应。由此可见，对CRISPR-Cas9功能进行高时空分辨率的精确控制，有利于减少脱靶效应，提高其特异性和作为研究/治疗应用的强大工具的潜力。

目前，已有一些研究尝试控制CRISPR-Cas9系统的活性释放，其中一种常用的方法是通过添加一个阻断序列，该序列与crRNA的间隔区杂交，从而阻断Cas9/crRNA/靶DNA复合物的形成，然后再以不同的方式打开阻断序列/间隔序列的杂交区域，从而恢复CRISPR-Cas9系统的活性。

在此项研究中，研究人员设计并构建了一个光调控的新型笼状CRISPR-Cas9系统——以一种新的、具有5'末端维生素E修饰的光敏crRNA为核心。研究团队首先合成了硝基苯乙二醇和维生素E的亚磷酰胺单体，然后偶联到crRNA的5'端，再从固体树脂中分离得到笼状crRNA（维生素E-PL-crRNA），然后进行进一步纯化和表征。

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光调节CRISPR/Cas9诱导DNA编辑的原理图

实验结果证实，在非光照条件下，维生素E修饰能阻断Cas9/crRNA/tracrRNA/靶DNA复合物的形成；而在365nm紫外光照射下，维生素E与crRNA的光敏连接被去除，从而恢复CRISPR-Cas9系统的切割活性。

紧接着，研究人员还评估了笼状crRNA在不同光照时间下的光敏性，他们发现在4min的光照射下，维生素E将完全脱离笼状crRNA。

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笼状crRNA在5'端进行维生素E修饰，阻断Cas9介导的DNA切割

为了进一步验证笼状crRNA控制CRISPR-Cas9系统的能力，研究人员还进行了体外DNA切割实验：crRNA/tracrRNA/Cas9蛋白1小时裂解靶DNA的效率约为58%，而笼状crRNA/tracrRNA/Cas9蛋白在相同的时间内仅观察到不到6.6%的靶DNA切割。

这表明维生素E修饰对CRISPR-Cas9系统的活性有十分明显的抑制作用。更重要的是，在光照射4min后，观察到Cas9诱导的靶DNA切割增强了7.6倍，效率恢复为50.2%，与阳性对照十分接近。

研究团队还探究了笼状crRNA阻断CRISPR-Cas9功能的具体机制。他们研究了Cas9蛋白与crRNA/tracrRNA双链和靶DNA的相互作用，并发现维生素E修饰不影响Cas9/crRNA/tracrRNA复合物的形成，但会抑制该复合物与靶DNA的相互作用。

除此之外，研究人员还在HEK293T细胞系中验证了笼状crRNA控制人类细胞基因编辑的能力，他们成功实现了光诱导的人类血管内皮细胞生长因子A （VEGFA）基因组编辑，并降低了EGFP稳定表达细胞系中的EGFP表达。

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针对HEK293T细胞VEGFA位点的Cas9/caged crRNA VEGFA/tracrRNA的基因组编辑活性

无独有偶，今年6月，美国约翰霍普金斯大学的研究人员在 Science 杂志上发表的题为：Very fast CRISPR on demand 的研究论文【2】。也提出了开发光敏crRNA的研究思路，从而利用光照精确操控基因编辑的时间。

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总而言之，汤新景团队的这项研究提供了一种调控CRISPR-Cas9系统活性的全新开发思路，并成功在体外切割实验和人源细胞系中验证了其有效性。由此可见，笼状crRNA的确可以应用于基础研究中的基因编辑。

该论文的第一作者张瑜表示：“笼状crRNA易于固相合成，且与其他核酸修饰相兼容，具有十分良好的应用前景，我们的笼状crRNA-CRISPR/Cas9系统仅需合成不同的笼状crRNA，就能用于不同的靶点，这比以前报道的诱导性sgRNA更方便。”

参考文献：

[1] https://doi.org/10.1002/anie.202009890

[2] https://science.sciencemag.org/content/368/6496/1265

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责任编辑：贾翰鼎_NBJ10744

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